摘要：骨桥蛋白（OPN）是一种分泌型糖基化磷蛋白，它影响损伤后细胞的存活、炎症、迁移和稳态。由于OPN在视网膜中的作用尚不清楚，本研究的目的是为了研究OPN在敲除小鼠中的缺失如何影响视网膜和年龄对这些效应的影响。本研究着重于3个月和20个月小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）和神经胶质细胞（星形胶质细胞、Müller细胞和小胶质细胞。测量视网膜中RGCs的数量，测量星形胶质细胞所占的面积。此外，在视网膜切片中观察了Müller细胞和小胶质细胞的形态。3月龄小鼠OPN的缺失降低了RGC密度25.09%，20月龄小鼠OPN的缺失降低了RGC密度60.37%. 3月龄小鼠的星形胶质细胞面积也减少了51.01%，而20月龄时，星形胶质细胞面积减少了57.84%，而Müller细胞和小胶质细胞似乎不受OPN缺失的影响。这项研究表明，OPN对星形胶质细胞和RGCs的影响，而在视网膜中缺乏OPN减少星形胶质细胞所占据的面积，并产生RGCS数量的二次减少。因此，OPN可能是开发抗神经退行性疾病的治疗的靶标，而星形胶质细胞可能是这种效应的关键介质。
关键词：视网膜 骨桥蛋白 视网膜神经节细胞 胶质细胞 星形细胞 Müller细胞 小胶质细胞
简介：骨桥蛋白（OPN）是由SPP1基因编码的分泌型糖基化磷蛋白。OPN是一种结合细胞表面整合素和CD44变异体的细胞因子，整合素在细胞中发挥多种功能，影响：细胞存活和凋亡、炎症、微钙化、细胞附着和迁移、细胞内信号传导、趋化性、损伤后的稳态维持和损伤后神经元再生的调节。OPN可以在神经系统、发育中和成年啮齿动物脑中发现，嗅球、视网膜、纹状体和脑干中的神经元产生OPN。OPN在生理条件下可能仅弱表达，但在炎症和神经退行性疾病中表达可能增加。在视网膜中，OPN由视网膜神经节细胞（RGCs）表达，神经元将视觉信号传递到大脑。RGCs也是最易发生缺血和兴奋性毒性的视网膜细胞，它上调OPN的表达，可能对实验性青光眼有保护作用。视网膜神经胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和Müller细胞维持视网膜内的稳态，在那里它们提供结构支持并影响代谢、吞噬神经元碎片、免疫反应和其他活动。反应性星形胶质细胞在不同类型脑损伤后表达OPN，并与实现巨噬细胞功能的小胶质细胞相关。在星形胶质细胞中，OPN在CNS损伤后活化的小胶质细胞中上调，提示其可能在神经炎症的发病机制中起关键作用。OPN与整合素αVβ3受体结合，这可能是缺血性损伤后胶质瘢痕形成过程中星形胶质细胞和小胶质细胞募集的趋化因子。事实上，OPN可能参与胶质细胞活化、细胞修复、胶质细胞和巨噬细胞迁移以及反应性星形胶质细胞的基质重塑。在此基础上，OPN对视网膜星形胶质细胞和小胶质细胞的作用值得研究。此外，在Müller细胞的分泌小体中发现OPN，因此，对它们的形态进行了研究，以了解OPN如何影响这些视网膜神经胶质细胞。衰老是神经退行性疾病的主要危险因素，OPN具有年龄依赖性的神经保护作用。正常视网膜老化的几种改变包括RGC丢失、星形胶质细胞表达GFAP（胶质纤维酸性蛋白）、细胞质细胞器的增加，小胶质细胞激活表型的获得。因此，比较OPN缺失对年轻（3个月大）和老年（20个月大）小鼠视网膜的影响是很重要的。本研究的目的是使用OPN敲除小鼠调查OPN缺失对RGCS，星形胶质细胞，小胶质细胞和Müller细胞的影响。此外，由于老化对OPN功能的影响尚不清楚，因此在不同年龄的动物中研究了这种缺陷的影响。
方法：动物：雌性敲除（B6129S6（CG）-SPP1 TM1BLH/J）和C57BL/6J小鼠，年龄3个月（n＝3野生型和n＝3敲除）和20个月龄（n＝4野生型和n＝4敲除）被用于这些实验中。动物自由采食和饮水，12/12的光暗循环，温度21℃.
组织采集：颈椎脱位后处死动物，眼球摘除。取出角膜、晶状体和玻璃体，仔细提取视网膜。在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中制备的4%多聚甲醛（PFA），立即固定视网膜5小时，然后延伸到滤纸上。为了获得切片，提取眼睛并立即固定在4% PFA过夜。然后在0.1M磷酸盐缓冲液中， 4℃下，在30%蔗糖中冷冻保存24小时，并将其嵌入OCT中。冰冻切片（14μm厚），保存于-20℃。
免疫化学：如以前所描述的，整个视网膜被免疫染色。固定视网膜在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中洗涤，在PBS－TX-100-BSA（0.25% TrITO-X 100和1%牛血清白蛋白）溶液中，在4°C下摇晃，将它们过夜封闭。然后将视网膜同一抗（PBS－TX-100-BSA中稀释）在4°C孵育1天。一种抗RBPMS（具有多剪接的RNA结合蛋白）的豚鼠抗体（1:4000）检测RGCs；和抗GFAP小鼠抗体（1:1000）检测星形胶质细胞。随后，视网膜在PBS中洗涤三次，持续15分钟，同在PBS－BSA（1%）中稀释1:1000的二抗结合：Alexa Fluor 555共轭山羊抗豚鼠抗体和Alexa Fluor 488共轭山羊抗鼠抗体. 最后，在PBS中，将视网膜冲洗三次，持续10分钟，将视网膜放置在切片上，并用PBS:甘油（1：1）封片。如前所述，小胶质细胞和Mü勒勒细胞在切片中免疫染色。切片用PBS－TX-100两次洗涤10分钟，然后用原代兔抗IBA 1抗体（1:2000）孵育过夜，以检测小胶质细胞,用兔抗谷氨酰胺合成酶抗体（1:10000），检测Müllle细胞。RGCs也用抗-RBPMS豚鼠抗体标记。用PBS清洗两次后，同二抗（Alexa Fluor 555或488羊抗兔或抗豚鼠）结合1h。切片用PBS洗涤两次，10分钟，并用PBS：甘油（1:1）安装盖玻片。
图像捕获：使用ZEN软件与荧光显微镜耦合的数码相机获得图像。在确定的视网膜的定义区域的重叠显微照片中定义镶嵌的面积，一旦定义了镶嵌，则测量视网膜轮廓并计算视网膜表面积。
RGC定量：采用ZESS软件对RGCS的数量进行半自动计数，并用t检验比较野生型和OPN敲除视网膜的RGC密度。此外，使用Mann-Whitney U检验来验证组间的差异。使用IBM SPSS统计软件V. 21进行统计分析。
星形胶质细胞形态学：我们计算了由星形胶质细胞占据的视网膜表面的比例，并在视网膜的最中心部分（直径为1毫米）和OPN敲除小鼠进行比较，在视神经上，星形胶质细胞分支的形态由于其复杂性而阻碍了它们的定量。
结果：对3和20月龄野生型和OPN敲除小鼠视网膜中的RGCs和星形胶质细胞进行标记，分别用RBPMS或GFAP抗体标记。OPN敲除小鼠的视网膜中有一些区域，细胞密度非常低，特别是在周边区域，距视神经2.5毫米。在这些区域中，随着年龄的增长，RGCS和星形胶质细胞的低密度被进一步夸大。在整个视网膜和每个视网膜的区域中标记RBPs的RGCs的数目被评估并计算它们的密度（RGCS/MM2）。3月龄野生型小鼠平均RGC密度（2607.15±38.36 rgcs/mm2）高于OPN敲除小鼠（1953.37±29.75 rgcs/mm2），20月龄动物（野生型小鼠平均RGC密度2101.86±84.73 rgcs/MM2）。20月龄OPN敲除小鼠平均RGC密度832.77±114.28 rgcs/mm2。因此，OPN缺陷在三个月时引起RGC密度的平均降低25.09%，在20月龄时进一步降低到60.7%.在野生型小鼠的视网膜中，星形胶质细胞形成一个覆盖整个视网膜、围绕血管的网络，它们通过恒星形态连接。相比之下，OPN敲除小鼠似乎有较少的星形胶质细胞。星形胶质细胞数目较少，分支较短，过程较少，提示星形胶质细胞萎缩。这种效应在20个月大的小鼠中比3月龄的小鼠更为严重，大面积缺乏星形胶质细胞和一些失去星形细胞形态的细胞。值得注意的是，OPN敲除小鼠视网膜中有更多的区域没有星形胶质细胞和更低的RGCS密度。3月龄野生型小鼠（33.05%±0.95）的星形胶质细胞所占面积大于OPN敲除小鼠（16.19%±3.47）。OPN的缺失使星形胶质细胞密度降低51.01%。在20月龄的小鼠中，星形胶质细胞所占的野生型视网膜的比例（21.67%±1.02）仍高于OPN敲除小鼠（9.14%±1.95），证实OPN的缺失降低了视网膜中的星形胶质细胞密度。此外，在3月龄OPN敲除小鼠中，RGCS的数量和星形胶质细胞覆盖的面积与20个月大的野生型小鼠的相同参数非常相似，在这两个年龄之间没有显著差异。在3个月或20个月的OPN敲除视网膜中没有检测到小胶质细胞活化的迹象。在存在和不存在OPN的情况下，小胶质细胞的形态是相似的。此外，在所有情况下，小胶质细胞位于视网膜的内部，这意味着它们不活跃，因为迁移到视网膜下空间是激活的标志。最后，我们没有检测到野生型和OPN敲除小鼠的Müller细胞在3个月和20个月龄之间的差异。在这两种情况下，由谷氨酰胺合成酶抗体标记的Müllle细胞以径向取向交叉视网膜，并且它们的过程包围视网膜神经元的细胞体。虽然20个月大的小鼠视网膜的形态可能发生改变，但Müller细胞继续围绕RGCS和感光细胞的胞体。
结论：缺乏OPN可能会导致过早老化。然而，小胶质细胞和Müller细胞似乎不受OPN缺乏的影响。因此，OPN可能是开发抗神经退行性疾病的治疗的候选分子，而星形胶质细胞可能是在这种情况下感兴趣的特定目标。